1、 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐

2、 水浴鍋

1、 PBS緩沖液（pH7.2―7.4）

2、 0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH6.0,1000ml）

3、 3%甲醇―H2O2溶液：用30% H₂O₂ 和80%甲醇溶液配制

4、 風(fēng)裱劑：

a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合

b. 油和TBS（PBS）配制

5、 TBS/PBS pH9.0–9.5，適用于熒光纖維鏡標本；pH7.0-7.4適合光學(xué)纖維標本

1、 脫蠟和水化：脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘

a. 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后在浸泡10分鐘

b. 無(wú)水乙醇中浸泡五分鐘

c. 95%乙醇中浸泡五分鐘

d. 75%乙醇中浸泡五分鐘

2、 抗原修復：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復。

福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來(lái)組織的抗原結構，蛋白多肽發(fā)生交聯(lián)，導致部分抗原表位封閉，結合位點(diǎn)減少，所以需要抗原修復，以暴露原來(lái)的抗原表位，達到充分顯露抗原，以不出現明顯脫片現象為佳。

抗原修復的幾種常用方法（供參考）

1、 微波爐加熱：

在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復1-2次。根據玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法”3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘，再溫火沸騰3分鐘即可。

適用的抗原：來(lái)源于人、大鼠、小鼠的組織標本；來(lái)源于其他動(dòng)物種屬的組織標本。

2、 沸熱修復：

電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。

3、 高壓熱修復：

在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門(mén)將會(huì )升起來(lái)。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門(mén)沉下去后打開(kāi)蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。（骨及軟骨組織的標本最好選擇較溫和的微波加熱修復） 。

4、 酶消化方法：

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37℃，消化時(shí)間約為5-30分鐘。

適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。

1、三步法（以SP試劑盒為例）

- 石蠟切片脫蠟至水

- 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復，可在此步后進(jìn)行

- 3% H₂O₂ 室溫孵育5~10分鐘，以消除內源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次

- 5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過(guò)夜

- PBS沖洗，2分鐘×3次

- 滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋?zhuān)?7℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗，2分鐘×3次

- 滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋?zhuān)?7℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗，2分鐘×3次

- 顯色劑顯色（DAB或AEC）

- 自來(lái)水充分沖洗，復染，脫水透明、封片

- 如果必要，可選用avdin封閉內源性生物素

2.SABC法

- 脫蠟、水化

- PBS洗2次各5分鐘

- 用蒸餾水或PBS配制新鮮的3% H₂O₂ ，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次

- 抗原修復

- PBS洗5分鐘

- 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體

- 滴加Ι抗50ul,室溫靜置1小時(shí)或4℃過(guò)夜或37℃1小時(shí)

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘

- PBS洗4次各5分鐘

- DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色

- 脫水、透明、封片、鏡檢

- 速凍組織

- 冰凍切片4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內，或進(jìn)行短暫預固定后儲存于-20℃冰箱

- 室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，也可根據需要選擇其他的固定方式

- PBS沖洗，5分鐘×3次

- 用3%過(guò)氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過(guò)氧化物酶的活性

- PBS沖洗，5分鐘×3次

- 下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開(kāi)始）

我們日常工作中所使用的組織固定液福爾馬林會(huì )引起組織蛋白內或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過(guò)程如下：

第一步：基本反應福爾馬林和氫反應形成新的化合物；

第二步：基本反應福爾馬林和氫反應形成新的亞甲基橋。

上述反應的結果導致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間，有人將這兩種因素對抗原修復的影響總結為下面的公式： 抗原熱修復的有效性=加熱溫度（T） × 加熱時(shí)間（t）。

也就是說(shuō)當我們修復時(shí)的溫度越低則需要修復的時(shí)間就越長(cháng)；反過(guò)來(lái)當修復溫度增高時(shí)修復的時(shí)間可以適當地縮短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關(guān)系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗結果“表1”中也可以清楚地看出。

如果修復強度不夠，免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復后暴露的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結果可能會(huì )非常弱，或出現假陰性，即使是陽(yáng)性結果，充其量只能起到定性的作用，不能適應今后對免疫組化進(jìn)行定量的需要。這就給我們診斷中定量指標的應用帶來(lái)困難，例如用來(lái)測定耐藥的指標。

大量的實(shí)驗表明，固定時(shí)間越長(cháng)的標本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復強度也就越強。有意思的是隨著(zhù)固定時(shí)間的延長(cháng)，組織中蛋白對溫度的耐受也相應增高，這可能就是我們對固定時(shí)間長(cháng)的標本加大修復強度的理論基礎。

這就提醒我們在做回顧性的研究時(shí)一定要注意所使用的修復條件，它與新鮮標本的修復條件一定是有所區別的，同等條件下一定要加長(cháng)修復的時(shí)間或提高修復所使用的溫度，才可能得到比較滿(mǎn)意的結果。

抗原熱修復中所使用的修復液pH值也會(huì )對染色結果產(chǎn)生相當大的影響。

pH值對染色結果的影響大概可以分為以下四種情況：

A.穩定型，pH值對染色結果影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等；

B.V型，高pH值和低pH值染色較好，而pH值4-5染色結果較差，如ER、Ki-67等；

C.上升型，隨著(zhù)pH值的增加，染色結果逐漸增強，如HMB45等；

D.下降型，隨著(zhù)pH值的增加染色結果逐漸減弱，當然這種類(lèi)型的抗體只是個(gè)別的現象，如MOC31。

一個(gè)有趣的現象值得注意，即在高pH值都有較好的染色結果，所以目前比較推崇的抗原修復液為高pH值得修復液，如1mMEDTA, pH8.0或pH9.0等。但是由于傳統習慣，絕大多數醫院和實(shí)驗室都在使用pH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國外免疫組化專(zhuān)家建議，在常規的免疫組化工作中，全部選用高pH值得修復液來(lái)代替目前廣為使用的pH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復液。經(jīng)驗證，絕大多數的抗體使用pH9.0得修復液效果都要優(yōu)于pH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽(yáng)性的抗體。所以，在常規的免疫組化工作中，使用高pH值的抗原修復液是今后的必然趨勢。

目前抗原熱修復所采用的方法主要有微波爐修復和高壓鍋修復兩種，從“表2”中可以看出，由于高壓鍋修復具有溫度均一、節省時(shí)間、效果穩定等特點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越受到人們的青睞。